蛋白质组学的发展历程和未来展望



【慧聪制药工业网】来自美国Scripps研究所的国际著名蛋白质组学专家JohnR.Yates教授应邀出席了近日召开的第五届亚洲与大洋洲质谱会议暨第33届中国质谱学会学术年会,并作大会报告。Yates教授在他的报告的前半部分中详细介绍了蛋白质组学的发展历程和未来的发展方向。

鸟枪法蛋白质组学的演变

提到蛋白质组学的发展,自然饶不开质谱技术的发展。在过去的100年里,质谱技术可以说是以指数级的速度迅猛发展。这种进步可以部分归功于机械、电子和计算机工业领域的创新。但一些偶然的颠覆性突破,可能才是质谱技术的发展在质上取得飞跃的根本原因。大规模蛋白分析或是蛋白组学之所以成为可能,正是由于这些颠覆性的突破而导致的。

当质谱具备分析有机分子的能力的时候,自然而然的,分析氨基酸和小肽就成为了下一个目标。由于这些两性和极性分子缺少挥发性以及早期质谱质量范围的限制,导致分析工作十分复杂。为了解决这个问题,人们巧妙地利用衍生化的办法来使这些被改性的氨基酸和小肽气化。同时利用EI源来碎片化这些分子,以实现肽段测序。随着高分辨率、精确质量仪器的出现,精确质量被作为一个工具用于小肽的测序。而对于小肽分析能力的获得使得我们可以利用酶解和酸解的办法对蛋白进行分析。通过产生重叠的肽碎片,蛋白的序列就可能被重建。很显然,这种策略将产生非常复杂的肽段混合物,从而对当时的分离技术(GC)提出了更高的要求。那时,最大的挑战来自于如何省去繁琐的衍生化步骤而实现肽的离子化,否则科学家的分析对象只能局限于那些高丰度蛋白。

一个颠覆性的突破发生在1981年,也就是快原子轰击(FAB)的发展。这是第一次使得人们可以无需对肽(其分子量可以达到〉1-2KDa)进行改性就可以完成很稳定的离子化。而这也对质谱仪器的质量范围提出了更高的要求。很快,这种离子源技术就被Hunt等人整合到了串联质谱上,从而为肽段测序提供了一种稳定的方法。

尽管FAB-MS和FAB-MSMS对于肽和蛋白分析而言是一个巨大的突破,但它们最主要的缺陷是很难直接与液相分离连接。1989年Fenn等人验证了电喷雾离子化(ESI)技术在蛋白分析方面的应用。除了可以电离大分子蛋白以及进行准确的质荷比测量外,这个方法的另一个突出特点就是实现了在大气压下的电离。这就简化了液相分离与质谱之间的接口。而在ESI这一颠覆性的创新出现后的几年里,FAB就渐渐被边缘化了。尽管和基质辅助激光解吸附离子化(MALDI)技术类似,围绕着这项技术的最初热情是集中在完整的蛋白质量的测量上,但是ESI的一个明显优势是通过与色谱技术(如:NanoLC)联用来完成更高效率的肽和蛋白的测序。

仪器控制语言(ICL)是由FinniganMAT最先开发出来的一项具有颠覆性的创新技术。它具有一个初级的“智能”水平,可以实现自动数据采集、数据交互和根据实时数据对仪器操作进行控制。ICL事后被证明可以提高MSMS和其他实验的效率,从而使得大规模蛋白组学成为可能。现在它已成为所有用于蛋白质组学的质谱仪器的一项标准技术。

“鸟枪法”应用于蛋白质组学是一个很重要的里程碑。在用鸟枪法为基因组测序的时候,先将基因组DNA打断,分段测序,然后利用计算机重组在一起,从而确定一个生物的基因组序列。鸟枪法在蛋白质组研究中的应用方式与此相类似。首先将蛋白质混合物降解成肽段的混合物,再送入质谱进行分析,从而得到各肽段的质量数。为了得到更丰富的序列信息,质谱仪会选取某些肽段进行再次破碎(即二级质谱),得到更小的氨基酸序列片段。检索软件根据二级质谱信息与相应的数据库匹配,可得到肽段的确切序列,进而拼接成混合物中各蛋白质的完整序列,从而鉴定各蛋白。因此可以说,串联质谱对于“鸟枪法”在蛋白组学中的应用是至关重要的,它们使得大规模、高通量的数据分析成为可能。这对于传统的蛋白分析方法而言,是颠覆性的。

大规模数据分析技术的发展使对蛋白混合物直接分析成为可能,人们可以即时收集和破译数以千计的串联质谱谱图。由于样品处理过程的简化,使得样品损失降到最低,从而可以达到一个很高的效率和灵敏度。这一点对于那些始终暴露于新的、活性表面的低丰度蛋白分析尤为重要,因为这种暴露会导致大量的样品损失。

随着分析蛋白复合物和亚细胞区室方法的建立,下一步的目标自然就对准了开发对完整细胞分析的方法。全细胞分析是一个很复杂的工作。开发全细胞分析方法的挑战主要来自于两个方面:首先,需要开发合适的消解蛋白混合物的策略;其次,要有好的方法来分离这些复杂的肽混合物。在全蛋白组分析中,对溶液中蛋白的初始消解是一个非常关键的起始点,因为高效且完全的消解对于获得高的蛋白组覆盖度至关重要。而蛋白组分离的目的则是为了尽可能在最短的时间里提高峰容量和分离效率。要实现这一个目标其实是很困难的。如果峰宽过窄,由于质谱仪扫描速度的限制,可能导致肽峰的丢失。因此,分离效率必须要和质谱仪器的扫描速度匹配。良好的分离对于降低离子抑制以及提高动态范围是很重要的,同时,它也推动了一次分析过程的蛋白序列覆盖度的不断提高。

鉴定蛋白功能


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