第三节 FCM对外周白细胞的免疫荧光分析



第三节 FCM对外周白细胞的免疫荧光分析

  外周血是临床检验中的重要标本。FCM分析外周白细胞的主要目的是了解各种白细胞的数目与分群情况。这些数字的变化与临床的某些疾病有一定的关系。近年来,由于多种识别白细胞膜表面抗原的单克隆抗体的发现,以及对这些单克隆抗体的直接或间接荧光标记物的出现,使得利用FCM的荧光组织化学分析获得被测细胞的多指标的更多、更准确的信息,这无疑对警觉临床和科研有很大帮助。本节 主要讨论有关外周血的白细胞的免疫荧光标记技术、数据分析及临床应用等方面的问题。

  一、白细胞的免疫荧光标记技术

  1.白细胞抗原下面给出世界卫生组织对白细胞抗原的统一命名,以及它们的分子量、对应的单克隆抗体及反应阳性的细胞(见表10-2)。

表10-2 WHO对白细胞分化抗原的命名

抗原 分子量 单克隆抗体 反应阳性细胞 CD1 P45/12 Leu6,T6,OKT6 胸腺细胞、朗格罕细胞 CD2 P50 Leu5 B,T11,OKT11 E玫瑰花受体、T和NK细胞 CD3 P19-29 Leu4,T3,OKT8 T细胞 CD4 P55 Leu3,T4,OKT4 协助—诱导T细胞,单核细胞 CD5 P67 Leu1,T1, T101 T细胞、B细胞亚群,慢粒(淋巴性) CD6 P120 T12 T细胞 CD7 P41 Leu9.3A T,T—ALLa和NK细胞 CD8 P32-33 Leu2,T6,OKT8 抑制-细胞毒T细胞、NK细胞 CD9 P24 BA-2 淋巴细胞白血病相关抗原 CD10 P100 CALLA, J5 粒细胞、前B白血病细胞 CD11 P170/95 CR3/Leu15,OKM1 单核细胞、粒细胞、NK细胞     MO1 T细胞亚群(C3bi受体) CD15 LNFP-I LeuM1 单核细胞、粒细胞、激活的T细胞 CD16 P50~70 Leu11 NK细胞、粒细胞(IgGFc受体) CD19 P95 Leu12,B4 B、CLLb前B-ALL细胞 CD20 P35 Leu16,B1 B细胞 CD21 P140 CR2,B7 B细胞、C3a受体细胞 CD22 P135 Leu41 B、CLL、和毛细胞白血病细胞 CD23 P45 Blast2 CD24 P45,P55 BA-1 B、CLL和前B-ALL细胞 CD25 P65 IL-2受体 数分裂因子激活的T细胞HTLV-I、II、感染细胞

  a:急性淋巴细胞性白血病;b:慢性淋巴细胞性白血病。

  2.样品的制备供FCM分析的样品是单细胞悬液,而且大部分样品都需经荧光染色。样品的制备方法大致有三种:①用荧光单克隆抗体染全血,随后溶解红细胞;②红细胞溶解后染色;③通过梯度离心法分离出单个淋巴细胞和单核细胞,再将之制成细胞悬液染色。

  (1)全血染色后溶解红细胞:由于不少血液标本具有生物危害性,用此方法可以将染色、溶解、固定、分析几个步骤都在一个试管内进行,这样减少转换过程中的污染。而且此法比用梯度离心分离出单个核细胞更节 省时间。由于此法未将粒细胞去除,故在用FCM分析时,要注意排除粒细胞的干扰。

  具体操作步骤如下:

  ①全血100~150μl,放入5ml试管,并用50~100μl PBS稀释,总体积为200μl。]

  ②荧光标记的单克隆抗体染色30min,4℃(或放于冰上)。单克隆抗体的浓度因不同来源差异很大,但为了使用方便,可按其说明书配成每次实验使用10μl。注意蔽光。

  ③用3~4μl冷BPS清洗。离心250×g(约每分钟1500转),5min,洗3次。注意每次用吸管将上清吸出,决不能倾倒去液!

  ④用2ml氯化铵液(配法见下)在室温下溶解红血球,约10min。若红细胞完全被溶解,溶液由混浊变到透明。注意溶解程度的掌握十分重要:若溶解过分,则导致白细胞上抗原被破坏,或者某些敏感的细胞死亡而导致比例的改变。若溶解不彻底,大量红细胞会影响对淋巴细胞的分析。这是因为淋巴细胞在分析图像上与红细胞群接近,在框出淋巴细胞群时,会把部分红细胞框定于淋巴细胞内。而红细胞溶解不足或过度在很大程度上影响着分析结果。

  【氯化铵液的配制】

  Tris—氯化铵1×氯化铵

  0.16mol/L  NH4Cl   0.38g/100ml   90ml   0.16mol/L  NH4Cl

  0.17mol/L  Tris   2.06g/100ml   10ml  0.17mol/l   Tris

  pH值7.56                 pH值7.2

  ⑤红细胞被彻底溶解,加入1ml PBS稀释的0.5%甲醛,立即离心,洗3次,条件同步骤③。加入甲醛的目的是尽早固定细胞和细胞上的抗原,避免有生物危害的标本到处污染。

  ⑥将染色完成的细胞悬浮于0.5~1ml的0.1%甲醛溶液内。置4℃,蔽光,等待分析。经固定后的细胞在冰箱内可保存一周,这样对工作的安排会带来方便。

  (2)红细胞被溶解后再对白细胞染色:此方法的优点是可以了解被染白细胞的数量以及存活率。但由于有时有些标本比较敏感,溶解红细胞后,还要经过多个染色步骤,这样容易造成抗原的丧失。此法具体步骤如下:

  ①室温下放入14ml氯化铵在15ml的试管里。

  ②加入0.5~1ml全血,混合3~5min。

  ③立即离心100~150×g,并用PBS洗2次。

  ④白细胞计数,注意存活率应在90%以上。做成每毫升含5×106白细胞悬浮液。将细胞分配到5ml的试管,每试管0.2ml,即1×106个细胞。

  ⑤荧光标记的单克隆抗体染色30min,4℃,避光。抗体浓度配制如前所述。

  ⑥PBS洗3次后,用0.5%甲醛固定。方法如前。




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