第五节 放射免疫分析法的建立



第五节 放射免疫分析法的建立

  一、放射免疫分析的基本试剂

  (一)标准品

  标准品是放射免疫分析法定量的依据,由于以标准品的量用来表示被涮物质的量,故标准品与被测物质应当化学结构一致并具有相同免疫活性。标准品作为定量的基准。应要求高度纯化。标准品除含量应具有准确性外,还应具备稳定性,即在合理的贮存条件下保持原来的特性。

  按实验要求,将标准品用缓冲液配成含不同剂量的标准溶液,用于制作标准曲线。

  (二)标记物

  标记抗原应具备:①比放射性高,以保证方法的灵敏度;②免疫活性好;③所用的核素的半衰期尽可能长,标记一次可较长时间使用,这对来之不易的抗原尤其重要;④标记简便、易防护。

  要准确测量B与F的放射性,必须有足够的放射性强度。所选用的标记抗原的量,在使用125I时达5000~15000cpm。

  (三)抗体

  应选择特异性高、亲和力强及滴度好的抗体,用于放射免疫测定。

  根据稀释曲线,选择适当的稀释度,一般以结合率为50%作为抗血清的稀释度。

  (四)B与F分离剂

  以2%加膜活性炭溶液为例,2%加膜活性炭溶液的配制:

  活性炭2g(杭州木材厂生产,森工牌732型)

  右旋糖酐T200.2g

  加0.1mol/L PB 至100ml

  电磁搅拌1h,然后置于变通冰箱冰箱待用。

  (五)缓冲液

  放射免疫分析技术所用的缓冲液有多种,要通过实验选用抗体和抗原结合最高的缓冲液。

  目前最常用的缓冲液有下列几种:①磷酸盐缓冲液;②醋酸盐缓冲液;③巴比妥缓冲液;④Tris –HCl缓冲液;⑤硼酸缓冲淮。其中以磷酸盐缓冲液应用最多。

  在缓冲液中,除必须有弱酸及弱酸的盐成分外,还应根据不同检测项目加入下列物质:①保护蛋白:常用的有牛血清白蛋白或白明胶,浓度为0.1%~0.2%,用以降低试管对抗原的非特异性吸附。②防腐剂:多采用0.1%叠氮钠、0.01%柳硫汞、溶菌酶或抗菌素。③酶抑制剂:如测定心钠素等肽类激素时,要加入适量的抑肽酶,用以抑制血浆内源性水解酶对待测物的降解;又如测定cAMP、cGMP时,需加入EDTA·2Na,抑制磷酸二酯酶的活性。④阻断剂:在测定甲状腺激素或测定某些甾体激素时,必须加阻断剂,使和蛋白质相结合的激素,变为游离型。常用的阻断剂有8—苯胺—1—萘磺酸、柳硫汞、水杨酸钠、三氯醋酸钠等。⑤载体蛋白:采用二抗作B与F分离剂时,要向反应液中加入适量与第一抗体同种动物的正常血清。在测定不含有血浆蛋白的样品时,用PEG沉淀剂分离B、F,必须加适量γ球蛋白或正常人混合血清。

  在神经肽的RIA时,常用PELH缓冲液,(按1000ml,pH7.6):

  0.1mol/l PB        980.0ml

  0.3mol/L EDTA·2Na     10.0ml

  0.2%洗必泰溶液       10.0ml

  溶菌酶           1.0g

  二、加样程序

  由于抗原、标记抗原和抗体三者加样次序不同,而出现两种加样程序,分述如下:

  (一)平衡饱和加样程序

  1.基本原理所谓平衡饱和,是指抗原和抗体反应达到再不结合,也不解离的平衡状态,称为饱和状态,即平衡饱和。所以,有人称此为饱和分析法。这意味着抗原或被测抗原、标记抗原、抗体三者一起温育。

  2.加样程序一般先加标准物或被测样品,再加抗血清,最后加标记物。这样的顺序是让标准物或被测物与抗体有短暂的结合,提高抗原的竞争抑制能力。

  在小分子半抗原的放射免疫分析中,标记抗原和未标记抗原与抗体结合的亲合力常常是不相同的,前者比后者的亲合力高。因此,上述加样程序就更有必要,所以一般都采用先加标准物或样品和抗血清,后加标记物。这样测定也比较稳定。

  在大分子蛋白质抗原的放射免疫分析中,如果是双抗体分离法,抗原和标记抗原与抗体三者加样,可不分先后,有的是标准物、标记物、抗血清的加样顺序,但一般习惯还是标准物或血样、抗血清、标记物、然后混匀温育24~48h,再加双抗体,继续温育24h,使免疫反应达到平衡。对一些多肽激素的放射免疫分析,应用双抗体分离法,其流程比较长,这样的顺序同样可不分先后。

  以大鼠垂体、下丘脑β-内啡肽RIA测定程序为例:

  (1)加样(单位μl;总反应体积500μl)

  标准曲线 样品   T NSB Bo 5Pg 10Pg 50Pg 100Pg 500Pg 1ng 垂体 下丘脑 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 β-EP标准液 / / / 100 100 100 100 100 100 / / 样品 / / / / / / / / / 1 100 β-EP抗血清 / / 100 100 100 100 100 100 100 100 100

  125-β-EP溶液 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 缓冲液 / 400 300 200 200 200 200 200 200 299 200

  (2)孵育:4℃,24h

  (3)分离B与F:每管加入2%加膜活性炭溶液300μl,摇匀,立即离心,去上清,测沉淀(F)的CPM数。

  (二)顺序饱和加样程序




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