免疫共沉淀 简介



蛋白质间相互作用研究方法:免疫共沉淀
1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。
2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。
3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。
4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min。
5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次。
6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min。
7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。
8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。
10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。
11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。




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