启动子克隆方法研究进展(4)



  很早就有用随机引物的PCR,但由于无法有效地控制由随机引物引发的非特异产物的产生,所以一直未能广泛应用。近年来由IJiu等设计的TAIL-PCR(Termal Asymmetric Interlaced PCR)又叫热不对称交错PCR,则解决了这个问题,后来有研究表明,经改良过的TAIL-PCR成功地从突变体中克隆到外源插入基因的旁侧序列,从而为启动子的克隆提供了有效的新方法。

  在利用特异引物和随机引物进行PCR中一般有3种产物生成:(1)由特异性引物和简并引物扩增出的产物;(2)由同一特异性弓l物扩增出的产物;(3)由同一简并引物扩增出的产物。在TAIL-PCR反应中,其中后2种目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。

  TAIL-PCR的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物(specialprimer,简称sp1,sp2,sp3,约20bp),用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物(Arbitrarydegenerate prime,AD,约14bp)相组合,以基因组DNA为模板.

根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环,通过分级反应来扩增特异引物(流程如图5所示)。

 

  TAIL-PCR共分3次反应。第一次反应包括5次高特异性、1次低特异、10次较低特异性反应和12个热不对称的超级循环。5次高特异性反应,使sp1与已知的序列退火并延伸,增加了目标序列的浓度;1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上;10次较低特异性反应使2种引物均与模板退火,随后进行12次超级循环。

经上述反应得到了不同浓度的3种类型产物:特异性产物(I)型和非特异性产物(Ⅰ型和Ⅲ型)。第二次反应则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板,通过10次热不对称的超级循环,使特异性产物被选择地扩增,而非特异产物含量极低。第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板,再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环,通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。

  Gento等曾用构建的含有潮霉素抗性基因(hph)的双元表达载体pBIG2RHPH2转化真菌,然后利用TAIL-PCR法克隆得到的真菌转化子基因组DNA的T-DNA插入区的旁侧序列并取得了成功。根据T-DNA区的HPH基因设计了扩增右边界的3个引物HS1~HS3,以及扩增左边界的引物HAS2~HAS4,另外又根据不同的转化子分别设计了简并引物ADl~AD3(引物位置如图6所示)。  

  在首轮PCR中,以AD/HS1为引物扩增右边界(以AD/HAS2扩增左边界),然后取首轮PCR产物为模板,以AD/HS2(AD/HAS3)进行二次PCR,再以二次PCR产物为模板,AD/HS3(AD/HAS4)为模板进行第三轮PCR,将3轮的PCR产物进行电泳分析结果表明,采用TAIL-PCR的方法成功地从突变体中获得了带有T-DNA左右边界的旁侧序列,从而证明了TAIL-PCR法是有效地扩增基因旁侧序列的方法,为启动子的克隆又增添了1种可行的方法。

  TAIL-PCR不需要PCR前的任何DNA操作,避免了环化和连接,速度快,特异性强,效率高,灵敏,在分子生物学研究的各个领域都有广泛的应用。





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