流式细胞术检测细胞凋亡(FITC



流式细胞术检测细胞凋亡(FITC-PI)

实验方法

1.用6孔板培养细胞,待细胞生长达到60%-70%,吸出旧培养基,根据实验需求处理,继续培养。

2.根据实验处理时间,把细胞培养液吸出至一合适离心管内,PBS洗涤贴壁细胞一次,加入适量胰酶细胞消化液消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时,吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。(注意:悬浮细胞不需要胰酶消化,直接收集到离心管即可)

3.加入步骤(2)中收集的细胞培养液,稍混匀,转移到离心管内,1000g离心5min,弃上清,收集细胞,用PBS轻轻重悬细胞并计数。(注意:加入步骤2)中的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞,另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶;残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-FITC导致染色失败。

4.取5-10万重悬的细胞,200g离心5 min,弃上清,加入195 μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。

5.加入5 μl Annexin V-FITC,轻轻混匀。

6.室温(20-25℃)避光孵育10 min。可以使用铝箔进行避光。

7.200g离心5 min,弃上清,加入190 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞。

8.加入10 μl碘化丙啶染色液,轻轻混匀,冰浴避光放置。

9.进行流式细胞仪检测,Annexin V-FITC为绿色荧光,PI为红色荧光。

注意:FITC为绿色荧光,此检测方法不适用于已带绿色荧光标签的细胞)


结果示例及分析

四个象限的意义

左上/P2-Q1:坏死细胞;

右上/P2-Q2:晚期凋亡细胞;

右下/P2-Q3:早期凋亡;

右下/P2-Q4:未发生凋亡的细胞。

细胞凋亡率:P2-Q2与P2-Q3象限百分率的和。




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