FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡



Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡

流式图

Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡

共聚焦图

一、原理

在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素(EGFP、FITC)标记,以标记了的Annexin V作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。与FITC的绿色荧光信号相比,EGFP的绿色荧光信号具有信号强,不易淬灭,稳定性高等优点,故本试剂盒采用EGFP作为荧光标记探针。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

二、操作步骤

1.悬浮细胞离心(2000rpm离心5min)收集;贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集(注:胰酶消化时间不易过长,否则容易引起假阳性);

2. 用PBS洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)收集1~5×105细胞;

3. 加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞;

4. 加入5μL Annexin V-EGFP混匀后,加入5 μL Propidium Iodide,混匀;

5. 室温、避光、反应5~15min;

6. 请在1 hour内,进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。

A. 荧光显微镜观察

1. 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上,并用盖玻片盖上细胞;

2. 对于贴壁细胞来说,也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡;

(1) 将细胞于盖玻片上生长,用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡,并设立阴性对照组;

(2) 用PBS洗涤细胞两次;

(3) 在500μL 的Binding Buffer中加入2μL Annexin V-EGFP, 5 μL Propidium Iodide,混匀;

(4) 将上述溶液滴加于盖玻片表面,使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖;

(5) 避光、室温反应5 min。

3. 将盖玻片倒置于载玻片上,于荧光显微镜下、双色滤光片(FITC和罗丹明)观察

Annexin V-EGFP荧光信号呈绿色,PI荧光信号呈红色。

B. 流式细胞仪分析

用流式细胞仪检测,激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。

Annexin V-EGFP的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测;PI红色荧光通过PI通道(FL2或FL3)检测,建议使用FL3。

荧光补偿调节:使用未经凋亡诱导处理的正常细胞,作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。



三、注意事项

1. Annexin V-EGFP,Propidium Iodide (PI)避光保存及使用。

2. Propidium Iodide (PI)有毒,操作时要戴手套。

3. 本试剂盒适用于检测活细胞,流式细胞仪检测时,细胞数量不以应低于1×105,,不适用于检测组织样本。

4.推荐使用悬浮培养细胞,如果是贴壁细胞,用胰酶消化不当,会引起假阳性,而用细胞刮子会造成细胞粘连成团,而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的PBS中,防止进一步的损伤。

5.因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同,因而流式检测的荧光补偿也不同,因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照,进行荧光补偿的调节。




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