超滤法浓缩蛋白质溶液实验



实验方法原理 超滤浓缩蛋白质是通过外力使蛋白质溶液通过滤膜而仍保留目的蛋白质的方法。实验室超滤主要是针对小体积蛋白质溶液(几毫升),用离心力的方法使溶液很容易通过滤膜。我们以 Amicon 系作为超滤的实例进行描述。这个方法不易引起蛋白质变性。

微型浓缩器初始容量有 2 ml 以及更小的,2 mg/ml 的牛血清蛋白(BSA)样品 2 ml 离心 30 min 可使体积浓缩至 50 ul 以下,然而浓缩的时间依所用超滤膜的类型、缓冲液的组成以及蛋白质的种类和浓度等因素而定。通过向浓缩的蛋白质溶液中加入新缓冲液及再离心,能很方便地更换蛋白质溶液的缓冲液和脱盐,四种型号浓缩器 Centricon-3、10、30 和 Centricon-100 分別能截留平均分子量为 3,10, 30 和 100 kD 的蛋白质组分。

实验材料 蛋白质溶液

试剂、试剂盒

仪器、耗材 Amicon Centricon 微型浓缩器磁力搅拌器和搅拌子

实验步骤

1. 组装 Centricon 微型浓缩器并加 2 ml 样品到样品池内;

2. 5000 × g 离心 30 min;

3. 去掉样品池的过滤管,盖上回收管;

4. 倒置浓缩器 1000 × g 离心 2 min;

5. 浓缩样品将移入回收管。另外用少量缓冲液洗涤滤器,能较完全地回收蛋白质。

注意事项

1. 离心时间依样品性质而定。 一般含有甘油的黏性溶液或蛋白质浓度较高时,需要离心时间较长。

2. 在典型的蛋白质回收率可高达 90% 以上。

3. 目的蛋白的分子置应大于浓缩器截流组分分子量的 30%~50%, 以确保目的蛋白截留成功。

4. 不同的滤膜具有不同的平均孔径,有利于根据蛋白质的大小选择合适的滤膜去浓缩蛋白。

5. Centricon 微量浓缩器的设计适用于固定角度的离心转头。由恰当的离心转头角度,使样品在达到死腔体积为 25~40 ul 时,不进一步浓缩,这样防止了样品被滤干。

6. 其他离心的超滤系统还有 Amicon Centriflo (7 ml 容积)和 Centriprep (15 ml 容积)两种浓缩器。

7. 为了浓缩大体积的样品,采用加压超滤系统耗时较长。Amicon 生产的带搅拌室超滤系统可适用于几百毫升溶液的浓缩。更大体积时则使用螺旋状的、蜂窝状纤维、或盒型膜装置。

8. Penefsky (1977)提出了一种可用于凝胶过滤脱盐的简单离心柱。




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