包涵体蛋白纯化与复性的方法简介及注意事项



什么是包涵体蛋白?

包涵体是在重组蛋白表达过程中,在细胞(菌体)内通过诱导新合成的肽链错误折叠,而发生聚集产生的不溶于水、无生物活性的聚集体。特别是在大肠杆菌表达真核细胞蛋白时最为常见。包涵体蛋白无生物活性,为此常常让需要制备活性蛋白来开展下游实验的科研工作者们头痛不已。

包涵体形成的原因

主要因为在蛋白表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适,无法形成正确的次级键等原因形成的。

包涵体形成原因
表达量过高   折叠时间不够  
二硫键非正确配对  
蛋白间存在非特异性结合  
蛋白溶解度太低  
氨基酸组成   含硫氨基酸(半胱氨酸,胱氨酸)  
脯氨酸(D型,亚氨酸,在蛋白结构折叠时往往需要异构酶辅助)  
蛋白所处环境   发酵温度高  
胞内pH接近蛋白的等电点  
异源蛋白   缺乏真核生物中翻译后修饰所需要的酶类  

包涵体蛋白的洗涤

包涵体蛋白的洗涤主要是洗去包涵体上的杂质,如外膜蛋白,质粒DNA等,方法上网上大同小异,但是注意一点,做包涵体的洗涤需要先做一个洗涤液的尿素浓度梯度,这样才能达到最佳的洗涤效果。如果洗涤效果好的话,合适的洗涤液洗涤3次后,目的蛋白的纯度可以达到90%左右,洗涤的效果通过page就可以看出来了,如果将洗涤液的浓度做一个合适的梯度,分别洗涤包涵体之后在一个板子上跑page,效果非常明显的。

包涵体蛋白的溶解

溶解这一步常常会出现溶解不完全等问题,首先要确定超声的质量很好,不然的话尿素没办法接触到包涵体也就达不到溶解的目的了。
其次,最好别在室温放置太长时间,如果有可能的话可以在包涵体洗涤液1,2都洗涤之后加入8M的尿素,然后再在每个EP管中加入15ul的DTT后4度冰箱过夜。 可以超声后低速离心如(4000/5min)去除细胞沉渣,因为低速离心不足以使包涵体沉淀,而细胞残渣和杂质却可以离的下来。
这样,过夜后,看看EP管内是否还有沉淀,如果没有的话就说明包涵体完全溶解了。

包涵体的复性

复性遵循的三原则:低浓度、平缓梯度、低温

复性是一个非常复杂的过程,除与蛋白质复性的过程控制相关外,还很大程度上与蛋白质本身的性质有关,以下这些包涵体蛋白复性注意事项前人总结的很好:

1.最适pH值范围为8.0-9.0之间;(这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成)
2.最适温度4℃;
3.低分子化合物 如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度;脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等,在非变性浓度下是很有效的促进剂,都可阻止蛋白聚集;Tris对蛋白质复性有促进作用;EDTA可以防止蛋白降解;
4.首先要获得较高纯度的包涵体;洗涤需彻底,加入适量Triton-X100
5.包涵体溶解要彻底,一般应使溶解液体量较大,不要怕蛋白被稀释,要有助溶措施;
6.透析前后均要离心;
7.复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h ;
8.复性率的测定时要据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定
9.复性时的蛋白浓度不宜太高,一般为0.1-0.5mg/ml,太高的浓度容易形成聚体沉淀,太低的浓度不经济,而且很多蛋白在低浓度时不稳定,很容易变性。

复性方法比较

复性方法 条件   优点   缺点   文献报道   质量回收率   活性回收率
稀释   低蛋白浓度   简单   易沉淀;速度不易控制;体积大   4倍体积稀释   约50%   80%  
透析   低蛋白浓度;多次透析   控制折叠,缓慢进行   易沉淀;不适合大规模操作;周期长   50倍体积透析液   /   约70%  
凝胶过滤层析   低蛋白浓度   柱上不保留;部分纯化   柱顶端易聚集   Superdex 75   约70%   84%  
离子交换层析   无盐酸胍;低盐浓度   利于二硫键形成;部分纯化   多点吸附,限制折叠   SP Sepharose High Performance   97%   88%  
亲和层析   含特殊结构,无强还原剂   特异性强;部分纯化;固定化分子可重复使用   成本高;配基易失活   固定化GroEL、DsbA/DsbC   100%   /  
亲和层析   含特殊结构,无强还原剂   特异性强;部分纯化;固定化分子可重复使用   成本高;配基易失活   固定化GroEL、DsbA/DsbC   100%   /  
疏水相互作用层析   高盐浓度吸附   抑制聚集;部分纯化   需优化   Poros PE   85%   86.3%  

复性过程中使用的添加剂




上一篇:阜宁配电柜回收阜宁高低压配电柜回收价钱好商
下一篇:包涵体纯化与复性的方法简介与案列介绍