3’RACE 实验心得



引子:从06年12月份开始,断断续续做了一个多月的3’RACE,有了一些心得和体会。期间看了很多前辈们分享的经验,受益匪浅。在这里,我就自己的经历略作总结,希望能给像我一样的新人们有点启示,少走些弯路,不当之处欢迎指正。

一、试剂盒的选择:3’RACE从原理上就能明白,它比5’RACE 要容易得多,所以并不一定需要用进口试剂盒。原来准备用Takara 3’RACE的试剂盒,可是看了一下它的原理和内容,觉得挺挫的,自己DIY可能效果更好一些呢。于是根据 Invitrogen GeneRacer Kit 自己DIY了,效果不错。找来了:Invitrogen的SuperScript III反转酶,TAKaRa LA Taq酶、Pyrobest高保真酶。
并根据 Invitrogen GeneRacer Kit,自己合成了3’接头引物(侵犯了人家知识产权):
3’接头:3'ap 5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T)18 -3'
54 bases
3’外侧:3'Primer 5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′ 25bases 76°C
3’内侧:3’Nested Primer 5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3′ 23bases 72°C

二、体会与心得
1、RNA的质量: RNA的质量对于3’RACE的成功至关重要, RNA的质量不好,其他全是白忙活。刚开始用了师兄半年前的RNA做不出来,后发现是由于RNA降解了,用新的RNA后问题就解决了。
所以提完了RNA后别怕麻烦,验证一下质量再往下做(看看OD260/280的值,再电泳检查一下),免得后面出了问题都没法找原因。
2、引物质量:引物的重要性也是在实验过程中慢慢体会到的,它往往是决定性的因素。刚开始为保险起见,我对应Invitrogen GeneRacer Kit提供的3’引物设计了内外两对引物(准备做巢式PCR,GSP1- 3’Primer and GSP2- 3’Nested Primer ),BTW:Invitrogen认为较高退火温度的引物特异性好一些。
  刚开始按部就班的做,先用GSP1- 3’Primer去扩增 ,再用GSP2- 3’Nested Primer做巢式 PCR 。也遇到了RACE常见的问题,3’-race第一轮PCR目的条带非常弱(没法回收),还伴有严重的smear。
  这就要解决二个问题: 1)减少非特异性扩增。 2)增加目的片段的产量。当时,优化了一些PCR条件,试了Touch down PCR,也用第一轮PCR产物作模板用GSP1引物做二次PCR ,也用了GSP2- 3’Nested Primer做巢式 PCR 。Touch down PCR、二次PCR的效果都不好。用巢式 PCR能得到目的片断,但效果也不怎么样。
  后来,一次心血来潮直接用GSP2- 3’Nested Primer做第一轮PCR,直接就扩增到了效果较好的目的片段(如下图),后来用高保真酶扩增时也只需要一轮PCR 就可以了。由此可见,引物的质量是决定性的。一对好的引物,不需要很费事的去优化条件就能得到好的结果;而一对特异性不怎么好的引物,即使用很多方法去优化也很难得到理想的结果。

3、扩增条件的优化:影响PCR的因素很多,但我觉得这其中模板质量、引物质量、引物退火温度是最具决定性的因素。而诸如:模板浓度、引物浓度、热启动、酶量、延伸时间、PCR循环次数、是否Touch down PCR,这些都是锦上添花的因素。
也就是说,如果目的条带能扩增出来,优化一下条件能扩增得更好;但是如果目的条带压根就扩不出来,你在这些锦上添花的东西上花再多精力也没用,这时候就应该考虑在决定性因素上找找原因。




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