RACE PCR简介



近年来随着生物技术的不断发展,出现了许多克隆新基因的方法和手段,如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3’末端的有效方法,以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。
经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术,主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端,包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善,克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等,1995:Schaefer,l995: Chen,1998: Bespalova等,1998: Matz等11999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物((lock docking primer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3'端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo(dT)16_30MN-3', M=A/G/C;N=A/G/C/T】,使引物定位在poly(A)尾的起始点,从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5‘端加尾时,采用poly(C),而不是poly(A);改进之三是采用RNase H一莫洛尼氏鼠白血.病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h (60 度 -70度 )有效地逆转录mRNA,从而消除了5‘端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR (hot start PCR)技术和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反应的特异性。
随着RACE技术日益完善,目前己有商业化RACE技术产品推出,如CLONTECH的MarathoTM技术和SMART TM RACE技术术。邢桂春等(2001)先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应,结果发现使用Marathon TM所得到的片断总是比采用SMARTsup]TMRACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于Marathon TM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5’末端。所以认为,进行RACE反应应当优选SMARTTM RACE试剂盒。以下就国内目前应用最广的SMART TM RACE试剂盒为例,简要概述RACE技术的原理和操作过程。 SMARTTM 3‘-RACE的原理是:利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点,以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer,GSP)作为上游引物,用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为下游引物,以cDNA第一链为模板,进行PCR循环,把目的基因3‘末端的DNA片段扩增出来。




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