qPCR 实验的关键步骤别再漏掉了!



还没开始就错了?RT-qPCR 实验的关键步骤别再漏掉了!

2022-07-27 17:01 来源: 戴老师的体育课堂

原标题:还没开始就错了?RT-qPCR 实验的关键步骤别再漏掉了!

「真的,我想哭了!RT-qPCR 实验结束,总能发现有些样本的 Ct 值明显延后,有几个甚至没有扩增,明明每一步都按照 SOP 规范操作,怎么就出来这么一个结果呢,也不知道哪个步骤出错了,无从下手,真是让人头大......」

屋漏偏逢连夜雨,偏偏导师还来问我实验进展:

qPCR 实验的关键步骤别再漏掉了!

导师

你的实验进展怎么样了?

不太好,有些样本的扩增结果不好。

导师

按照你师姐给你的 SOP 操作了吗?

我按照 SOP 里的实验步骤一步步操作,结果就是不太好。

这时候师姐也来凑热闹。

qPCR 实验的关键步骤别再漏掉了!

师姐

我看师弟之前做了性能验证,方法上应该没问题,基因表达分析实验的起始步骤是 total RNA 提取,提取产物有没有检测?

用分光光度计检测了,都是正常的。

qPCR 实验的关键步骤别再漏掉了!

师姐

那 RNA 完整性测了吗,样本抑制物检测做了吗?

我......没做过。

后来,师姐完整地教了我一遍,并给了我下面这份「不外传」的 秘密宝典。

一、样本质量是 RT-qPCR 实验成功的关键因素之一

使用 高纯度(不含 DNA 和蛋白质及抑制物)和高度完整(无降解)的 RNA 进行实验是整个 RT-qPCR 实验流程中很关键的环节。降解或污染的 RNA 会产生低质量的 cDN A,从而导致 qPCR 反应效率低下,并导致不准确的低质量数据,具体表现为:

RNA 不纯将导致对下游 PCR 反应的抑制,Cq 将右移,产生数据偏差。

若 RNA 发生降解,将导致不正确的结果。

RNA 的纯度和完整性是不相关的两个指标,都需要进行检测以确保高质量的 RNA 用于下游实验。

对于 RT-qPCR,要尽力避免所谓的「garbage in = garbage out」。获得高品质 RNA 需要注意:

1、尽量避免 RNA 酶污染,使用无 RNA 酶的耗材和试剂,戴手套口罩,建议将提取和扩增的场所分开。

2、尽量减少采样时间,样品处理后快速冷冻,可以加入 RNA 保护剂。

3、RNA 提取过程中可以使用 RNA 酶抑制剂。

4、样本存储过程中避免反复冻融。

5、必要的情况下,分装 RNA,并在乙醇或异丙醇中于 -80 ℃ 下保存。

二、RNA 样本质量评估方法

判断一份样本是否合格,需要考察 RNA 浓度(总量)、RNA 纯度、RNA 完整性、抑制物(污染物质)等方面。常用的方法如下:

1、UV 吸光度检测

260 nm 吸收值计算 RNA 浓度,再乘以体积可以计算 RNA 总量;测量 260 nm/280 nm 吸收值的比值,用于评估 RNA 纯度,纯度的要求如下:

A260/280 = 2 (1.8~2.2;<1.8,说明有蛋白质残留;>2.2,说明 RNA 可能发生降解)

A260: 0.15~1

A260/230 = 2.5(> 2.0)

2、电泳分析 RNA 条带

通过琼脂糖凝胶电泳可以大致评估 28 S 和 18 S 的比值,用于检测 RNA 完整性。判断合格的标准是 28 S 和 18 S 条带明亮、清晰,且 28 S:18 S ≈ 2:1;如果 RNA 降解,则会出现弥散状条带;如下图所示:

qPCR 实验的关键步骤别再漏掉了!

图 1. RNA电泳条带

但电泳分析 RNA 质量存在以下不足:

需要相对大量的 RNA(5~10 μg),当 RNA 总量较低时,可能无法开展。

肉眼评估,比较主观

耗时长,耗费工作量

通量低,不适合大量 RNA 样本分析

不能反映是否存在 g DNA 污染

3、微流体毛细管电泳系统(分析 RNA 浓度和完整性)

目前已经有成熟并广泛应用的生物分析仪,如 Agilent 2100、Experion™ 自动电泳工作站等。




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