Mol Neurodegener:胆固醇如何影响阿尔茨海默病线粒



  导读:

       线粒体是维持细胞内环境稳定的重要细胞器,线粒体自噬介导的对缺陷线粒体的清除受损是阿尔茨海默病(AD)发病机制中的关键事件。近期,《Molecular Neurodegeneration》期刊发表了题为“Cholesterol alters mitophagy by impairing  optineurin recruitment and lysosomal clearance in Alzheimer’s disease”的论文,作者团队揭示了一种新的机制,将胆固醇诱导的线粒体氧化应激与线粒体清除减少和AD进展联系起来。胆固醇对PINK1-Parkin介导的线粒体自噬具有双重作用,一方面损害溶酶体对线粒体自噬体的清除,另一方面促进氧化诱导的OPTN聚集体的积累,从而阻止PINK1/Parkin激活的线粒体募集。

  1. 胆固醇促进Aβ诱导的线粒体吞噬小体形成,同时损害溶酶体对线粒体的清除

         为了研究细胞内胆固醇对线粒体自噬的影响,作者团队首先用水溶性胆固醇复合物(CHO:MCD)处理人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,并将其暴露于10μM寡聚体Aβ中24 h。处理后通过对细胞进行菲律宾菌素(0.25 mg/ml)染色证实了胆固醇含量的增加,菲律宾菌素是一种能特异性结合胆固醇的荧光多烯抗生素。荧光显微镜图像显示CHO:MCD处理的细胞内染色较高且均匀(图1a)。自噬诱导后,自噬小体形成的一个关键条件是胞液LC3B在吞噬体膜上的募集以及随后与磷脂酰乙醇胺的结合。因此,脂化LC3B(也称为LC3B-II)水平已被广泛用作自噬体内含量的衡量标准。如图所示(图1b),当溶酶体亲和剂氯喹(CQ)阻断自噬通量时,Aβ可诱导富含胆固醇细胞的自噬小体合成,使LC3B-II:LC3B-I比值显著增加。为了分析细胞中的线粒体自噬,我们接下来用抗LC3B和细胞色素C(CYC)的抗体进行双重免疫染色,作为线粒体的标志(图1c)。正如预期的那样,共聚焦显微镜显示在Aβ孵育后有更多的自噬小体(LC3B点状)存在。在富含胆固醇的细胞中,LC3B阳性囊泡和线粒体标志物之间的共存程度更高(图1C)。然而,尽管自噬小体的形成增强,但当细胞胆固醇含量较高时,溶酶体标记LAMP2(溶酶体相关膜蛋白2)和CYC之间没有明显的共定位(图1d)。因此,作者认为富含胆固醇的细胞中有线粒体自噬小体积累的部分原因是自噬分解有缺陷。

         为了评估活细胞中的线粒体自噬通量,作者使用了针对线粒体基质的单体keima探针和线粒体靶向信号肽序列(mt-mkeima)。在线粒体的生理pH下,mt-mKeima在440 nm处的激发占主导地位,然而,当线粒体被输送到酸性溶酶体环境中时,mt-mKeima的激发光谱的峰值从440 nm移动到586 nm。利用这些特性,稳定表达mt-mKeima的慢病毒转导SH-SY5Y细胞胆固醇富集,并在Aβ暴露后用共聚焦显微镜分析自噬溶酶体的形成(图1e)。在暴露于细胞毒肽48h的对照细胞中,mt-mKeima的双激发比成像显示在561 nm的激发波长处有强信号的细胞质斑点结构(图1e)。有趣的是,与免疫细胞化学的结果一致,当暴露于Aβ的细胞预先被胆固醇富集时,在561nm处没有观察到荧光信号,这表明线粒体向溶酶体的输送受到干扰(图1e)。因此,如前所述,根据这些比率图像计算的线粒体自噬指数,在暴露于Aβ的对照细胞中随着时间的推移而累积增加,而在CHO:MCD处理的细胞中保持不变(图1f)。因此,细胞内胆固醇水平的上升损害了线粒体自噬通量,而不考虑线粒体的损伤。

图1 SH-SY5Y细胞中胆固醇的富集增强了Aβ诱导的线粒体自噬小体的形成,同时损害了溶酶体对线粒体的清除

  2. 胆固醇介导的线粒体谷胱甘肽耗竭促进暴露于Aβ的胚胎皮层/海马神经元PINK1介导的不完全线粒体自噬

         由于神经元对线粒体功能的能量依赖性很高,而且神经元不能通过细胞分裂来稀释线粒体损伤,所以在原代神经元培养中观察到的富含胆固醇的SH-SHY5Y细胞的线粒体自噬改变可能是不同的。为了评估这一可能性,将野生型(WT)和SREBF2小鼠的胚胎皮层/海马神经元与5μM的 Aβ孵育24小时,并用抗LC3B和抗CYC抗体进行双重免疫染色(图2a)。共聚焦图像显示,在Aβ处理后,细胞胞体中有明显的LC3B阳性结构积累,这些结构与线粒体标记部分共存(图2A)。与WT细胞相比,SREBF2细胞中线粒体与LC3B斑点的共定位程度显著高于WT细胞(图2a)。同时,通过抗LAMP2和抗CYC抗体的共同免疫染色来评估线粒体自噬溶解的能力。共聚焦显微镜显示,在Aβ(图2B)诱导的WT细胞中,双重染色的CYC和LAMP2阳性结构数量增加。相反,在SREBF2细胞中没有发现线粒体和溶酶体标记之间明显的共定位(图2b),因此,表明了在胆固醇富集的SH-SY5Y细胞中观察到的线粒体自噬通量缺陷。同样值得注意的是,在WT细胞中,溶酶体主要分布在神经元胞体中,并与线粒体标记共存,而在SERBF2细胞中,在Aβ或雷帕霉素刺激后,溶酶体仍均匀分布在核周和轴突上(图2b)。此外,与WT细胞不同的是,SERBF2细胞中的线粒体在诱导线粒体后大多积累在胞体中,在轴突中显示出更多的碎片化模式(图2b)。

         此外,在富含胆固醇的神经元培养中,由Aβ诱导的LC3B阳性囊泡的在用谷胱甘肽乙酯处理后被消除。谷胱甘肽乙酯是一种细胞渗透型的谷胱甘肽,可恢复线粒体谷胱甘肽池并防止Aβ引起的氧化损伤。与这些数据一致的是,GSHee预处理显著抑制了SREBF2细胞的线粒体自噬(图2c)。线粒体还原型谷胱甘肽恢复后,Aβ处理的SREBF2细胞共聚焦显微镜显示CYC和LC3B阳性小泡明显减少。GSHee处理还减少了PINK1在这些细胞中的线粒体积累,共聚焦显微镜显示关键的线粒体自噬蛋白和线粒体标记之间无共定位(图2c)。此外,共聚焦显微镜分析表明,PINK1的线粒体稳定和随后的Aβ诱导的SREBF2细胞在没有Parkin募集的情况下发生了线粒体自噬(图2d)。细胞内的E3泛素蛋白连接酶仅在钾离子载体缬氨霉素处理后出现移位,这些发现表明,Aβ在培养的原代神经元上触发了PINK1介导的parkin非依赖性线粒体自噬,这种作用因胆固醇诱导的线粒体谷胱甘肽耗竭而加剧,并且线粒体膜电位没有丧失。




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